（一）耐热β葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的重组表达、纯化、性质分析和低乳糖巴氏牛奶的生产工艺研究 （二）Dihydro-CDDO-trifluoroethyl amide通过靶向激活Nrf2负性调节LPS诱导的炎症反应

【摘要】背景乳糖不耐症是近年来引起广泛关注的一种疾病,大多数患者由于乳糖酶表达异常,在进食牛奶和乳制品后不能将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,导致乳糖在肠道堆积并被肠道菌群发酵后,产生腹痛、腹胀、腹泻、恶心和呕吐等胃肠道症状及其他全身性症状。乳糖不耐症的患者出于对以上不适症状的恐惧,一般都拒绝食用牛奶和乳制品,从而丧失了一种优质的高蛋白质和高矿物质食品,他们当中的很多人因为维生素D和钙的摄入量不足,发生了骨质疏松甚至骨折等病变,很大程度上影响了他们的身体健康。由于乳糖是由一分子半乳糖和一分子葡萄糖构成的二糖,因此无论半乳糖苷酶或葡萄糖苷酶都可以将其水解成单糖。基于这一特点,许多科研人员都尝试利用外源性的半乳糖苷酶或葡萄糖苷酶水解牛奶中的乳糖。由此而产生的低乳糖牛奶因为乳糖含量很低,饮用后不会发生明显的胃肠道症状,故可以无障碍的被乳糖不耐症的患者接受。许多生物体如动物、植物、细菌、真菌(包括酵母菌)都能合成乳糖酶,目前广泛应用于工业生产的乳糖酶是来自于真菌(包括酵母菌)的半乳糖苷酶,但是它们基本上都存在两个明显的不足之处——第一是耐热性不好,遇高温后会失活,故需要在巴氏消毒之后加入,增加了牛奶污染的几率；第二是酶活性受到产物的抑制,在水解过程中随着半乳糖和葡萄糖的浓度升高,水解效率会逐步降低,导致乳糖的水解不充分和酶添加量的被动增加,提高了低乳糖牛奶生产的成本。由于半乳糖苷酶的以上不足之处,人们逐渐将目光投向了葡萄糖苷酶,尤其是耐热的葡萄糖苷酶。高度嗜热的古细菌Pyrococcusfuriosus可以自然合成多种耐高温酶,如淀粉酶、葡萄糖苷酶和甘露糖苷酶等,其中的β葡萄糖苷酶耐热性极佳,在100℃的高温下经过85个小时还能具有一半以上的活性。这为其应用于巴氏消毒条件下低乳糖牛奶的生产奠定了基础。在本实验中,我们将从Pyrococcusfuriosus中分离出来的β葡萄糖苷酶基因celB导入到毕赤酵母中进行异源表达,并对重组蛋白进行了纯化、性质分析和巴氏消毒条件下低乳糖牛奶的生产工艺研究,希望能为工业化生产食品级低乳糖巴氏消毒牛奶提供一定的理论依据。目的1.在毕赤酵母中重组表达从耐高温的古细菌Pyrococcusfuriosus中分离出来的β葡萄糖苷酶基因,并对重组表达的蛋白进行纯化和性质分析；2.在巴氏消毒条件下,使用重组表达的β葡萄糖苷酶水解牛奶中的乳糖,并对不同的参数进行分析。方法1.β葡萄糖苷酶基因片段的获取、质粒构建及向毕赤酵母中的转化。2.分批补料式发酵法培养毕赤酵母及蛋白表达和酶活性情况测定。3.SDS-PAGE法检测目的蛋白。4.重组β葡萄糖苷酶的分离和纯化。5.重组β葡萄糖苷酶的酶活性测定。6.温度对重组β葡萄糖苷酶活性和稳定性的影响。7.pH值对重组β葡萄糖苷酶活性和稳定性的影响。8.金属离子对重组β葡萄糖苷酶活性的影响。9.在巴氏消毒条件下,重组β葡萄糖苷酶对牛奶中乳糖水解工艺的研究。结果1.重组β葡萄糖苷酶的表达。经过120个小时的连续发酵培养,菌体湿重达到了312g/L,经Bradford法测定发酵液上清中蛋白表达量为740mg/L,β葡萄糖苷酶活性达到271U/mL。SDS-PAGE后经考马斯亮蓝染色显示在分子量120kDa处出现逐渐增强的特异性蛋白条带,此条带与预计的β葡萄糖苷酶双体的分子量大小相符。2.重组β葡萄糖苷酶的纯化。发酵液离心后,将上清通过DEAE阴离子交换层析柱进行纯化,通过一步法纯化工艺,可使蛋白纯度较前提高1.9倍,且酶活性保存大于80%。3.重组β葡萄糖苷酶的性质分析。通过对重组酶进行性质分析发现——(1)重组酶的最适反应温度是100℃,在30-120℃之间孵育1小时对酶活性的影响不足20%；(2)重组酶的最适反应pH值为6.0,在pH值5.0-8.0之间孵育1小时酶活性至少还存在80%；(3)除铜离子可以降低重组酶22%的活性之外,其他金属离子对重组酶的活性影响很小。4.巴氏消毒条件下,重组β葡萄糖苷酶对低乳糖牛奶的生产工艺研究。(1)在常规巴氏消毒条件下(65摄氏度30分钟),62U/mL的重组酶即可水解牛奶中70%以上的乳糖,而498U/mL的重组酶可以水解牛奶中90%以上的乳糖；(2)在快速巴氏消毒条件下(65摄氏度20分钟),重组酶对牛奶中乳糖的水解能力与常规巴氏消毒条件类似；(3)高浓度的反应产物(5%葡萄糖)对重组酶的活性影响很小。结论1.本研究首次在毕赤酵母中重组表达了从耐高温的古细菌Pyrococcusfuriosus中分离出来的β葡萄糖苷酶,并对重组酶进行了纯化和性质分析；2.本研究初步建立了在巴氏消毒条件下使用该重组酶生产低乳糖牛奶的工艺,这一方法改善了此前需要在巴氏消毒之后再向牛奶中添加乳糖酶的生产方法,可以降低微生物污染的发生率。背景固有免疫是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线。巨噬细胞作为固有免疫中的一个重要成分,通过分泌不同功能的细胞因子、小分子炎症介质和胞外酶类物质,直接或间接的参与炎症反应和免疫调节的过程。尽管巨噬细胞活化后,产生的促炎性细胞因子、小分子炎症介质和胞外酶类物质在清除微生物感染中发挥着重要的作用,但是巨噬细胞过度活化,促炎性物质的过度产生,将导致炎症迁延不愈,成为多种慢性疾病共同的发病基础。因此,严格的控制促炎性细胞因子和其他炎症介质的产生和清除显得尤为重要。转录因子Nuclearfactor-erythroid2-relatedfactor2(Nrf2),是具有亮氨酸拉链结构(basicleucinezipper)的Cap’n’collar(CNC)家族的重要成员。大量文献报道,Nrf2在多个不同的组织器官(如肺、肝脏、胃肠道、膀胱、肾脏、大脑、皮肤、卵巢和心脏等)中均具有调节细胞防御来抑制疾病侵袭的作用,因此,Nrf2成为治疗和预防人类疾病的重要药物靶点之一。许多天然的和人工合成的化合物具有不同程度的Nrf2激活作用,如姜黄素、茶多酚、白藜芦醇和安卡黄素等。但是到目前为止,来源于齐墩果酸的三萜类化合物仍然是最强的Nrf2激活子,因此,选择和合成低毒性高活力的三萜类化合物及其衍生物就成为目前研究的一个热点。Dihydro-CDDO-trifluoroethylamide(Dh404)是最新合成的来源于齐墩果酸的三萜类化合物之一,其对Nrf2具有强有力的激活作用。目前研究显示,其在小鼠和大鼠中的耐受性良好,且可以显著改善实验动物的肥胖、2型糖尿病及压力负荷引起的心肌重构等。但是,其在抑制炎症方面的作用及机制尚未得到充分阐明。因此,我们建立了LPS诱导巨噬细胞损伤的体外模型,观察了Dh404对LPS所诱导炎症的抑制作用,并探讨了其可能的保护机制,为将来临床应用Dh404提供了新的理论依据。目的1.建立RAW264.7细胞和小鼠骨髓来源巨噬细胞在LPS刺激下的炎症损伤模型；2.观察Dh404对RAW264.7细胞和小鼠骨髓来源巨噬细胞在LPS刺激下炎症的变化情况,并探讨其可能的保护机制。方法1.培养RAW264.7细胞和小鼠骨髓来源巨噬细胞进行实验研究。2.LDH检测Dh404对RAW264.7细胞活性的影响。3.双荧光素酶报告基因检测NFκB和Neh2转录活性。4.Q-PCR检测基因表达。5.Westernblot检测蛋白表达。6.免疫荧光检测蛋白表达。7.流式细胞术检测骨髓来源巨噬细胞的诱导情况。8.应用SPSS统计软件进行单因素方差分析,P<0.05有统计学差异。结果1.Dh404对RAW264.7细胞活性的影响。10nM、25nM、50nM、100nM和200nM的Dh404均不对RAW264.7细胞产生毒性作用,而在500nM、1000nM和2000nM的浓度下,细胞活性下降。因此,在随后试验中均采用对细胞无毒性的200nM的Dh404进行研究。2.Dh404抑制炎症标记物iNOS、MCP-1和MIP-1β的表达。与LPS(1ug/mL)组相比,LPS(1ug/mL)+Dh404(200nM)组可以显著降低iNOS在mRNA和蛋白水平的表达。同时,我们发现,Dh404可以显著降低LPS诱导的MCP-1和MIP-1β的基因表达水平,提示其具有抑制炎症的作用。3.Dh404的作用独立于MAPKs信号途径。与对照组相比,LPS(1ug/mL)组可以明显升高MAPKs(包括ERK,P38和JNK)的磷酸化表达水平,但是LPS(1ug/mL)+Dh404(200nM)组对LPS诱导的MAPKs表达升高没有明显的抑制作用。4.Dh404的作用独立于JAK-STAT信号途径。与对照组相比,LPS(1ug/mL)组可以明显升高JAK-STAT信号途径(包括JAK1,JAK2和STAT3)的磷酸化表达水平,但是LPS(1ug/mL)+Dh404(200nM)组对LPS诱导的JAK-STAT表达升高没有明显的抑制作用。5.Dh404的作用独立于NFκB途径。与对照组相比,LPS(1ug/mL)组可以明显降低IκBa的蛋白表达水平,但是LPS(1ug/mL)+Dh404(200nM)组的IκBa蛋白表达水平并无明显恢复；LPS(lug/mL)组可以明显升高NFκB的荧光素酶表达水平,但是LPS(1ug/mL)+Dh404(200nM)组的NFkB的荧光素酶表达水平并无明显降低；LPS(1ug/mL)组可以明显升高炎症因子IL-1β、IL-6和TNFa的表达水平,但是LPS(1ug/mL)+Dh404(200iM)组对LPS诱导的炎症因子IL-1β、IL-6和TNFa的表达也没有明显的影响。6.Dh404增强Nrf2途径。与对照组相比,Dh404(200nM)组可以迅速增强Nrf2蛋白在胞浆及胞核的累积表达量,同时增强NQO1和HO-1的基因及蛋白表达量,提示Dh404可以明显激活RAW264.7细胞中Nrf2通路的表达。但是,Dh404(200nM)组并不升高Nrf2的基因表达水平,提示Dh404对Nrf2的调节作用发生在转录后水平；双荧光素酶报告基因检测也提示,Dh404(200nM)组不能升高Neh2的表达水平,说明Dh404不能直接分离Neh2和Keap1的结合,提示Dh404不是通过直接分离Nrf2与Keap1的结合来发挥增强Nrf2途径的作用。7.Dh404通过靶向作用于Nrf2负性调节LPS诱导的炎症反应。分别用LPS(1ug/mL)和LPS(1ug/mL)+Dh404(200nM)来刺激Nrf2野生型和Nrf2基因敲除型小鼠骨髓来源的巨噬细胞后观察相关炎症标记物的基因和蛋白表达情况,结果发现：(1)在Nrf2敲除小鼠骨髓来源的巨噬细胞中,LPS诱导的炎症反应明显强于野生型小鼠,提示Nrf2本身具有抑制炎症的作用；(2)在加入Dh404进行干预之后,野生型小鼠中LPS诱导的炎症标记物水平明显下降,而在Nrf2敲除小鼠中Dh404的抗炎作用则几乎完全丧失,这提示Dh404是通过靶向作用于Nrf2负性调节LPS诱导的炎症反应。结论1.Dh404可以抑制RAW264.7细胞和小鼠骨髓来源巨噬细胞中LPS诱导的炎症反应；2.Dh404抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症的作用独立于MAPKs、JAK-STAT和NFκB信号途径；3.Dh404具有增强转录因子Nrf2及其下游基因表达的作用。4.Dh404靶向作用于Nrf2负性调节LPS诱导的炎症反应。
【作者】李斌；
【导师】唐东起；崔泰兴；
【作者基本信息】山东大学，免疫学，2014，博士
【关键词】Pyrococcusfuriosus；耐热β葡萄糖苷酶；毕赤酵母；巴氏消毒；乳糖水解；Dh404；巨噬细胞；炎症；NFκB；Nrf2；

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